Le 1er avril 1865, la première réunion (sur les huit) de la Commission d’organisation du musée se réunit sous la présidence du Comte de Nieuwerkerke, surintendant des Beaux-Arts (en quelque sorte notre Ministre de la Culture). Cette Commission regroupe de grands noms de l’archéologie comme Alexandre Bertrand, Édouard Lartet, Félix de Saulcy, et Jacques Boucher de Perthes ; Le projet définitif sera l’œuvre de Auguste Verchère de Reffye, Alexandre Bertrand et Claude Rossignol. Le premier directeur du musée est Alexandre Bertrand. Il va adopter le classement chronologique des objets alors que jusque-là a prévalu le classement par matière.
Le premier règlement du musée, en 1866, précise que « le musée de Saint-Germain a pour but de centraliser tous les documents relatifs à l’histoire des races qui ont occupé le territoire de la Gaule depuis les temps les plus reculés jusqu’au règne de Charlemagne ; de classer ces documents d’après un ordre méthodique ; d’en rendre l’étude facile et à la portée du public ; de le publier et d’en propager l’enseignement ».
Le Musée des Antiquités nationales est donc le premier musée consacré entièrement à l’archéologie du territoire national.
Les sept premières salles sont inaugurées par l’Empereur le 12 mai 1867, sous une pluie battante. Cette date avait été choisie en relation avec l’Exposition universelle. Quarante-quatre salles sont ouvertes au public en 1907.

L’histoire du musée des Antiquités nationales est inséparable de celle du développement de l’archéologie française et européenne. Parmi les toutes premières collections à être entrées figurent celles de Jacques Boucher de Perthes aux environs d’Abbeville (Somme) qui révélèrent, à la fin du XXe siècle, l’existence d’une humanité préhistorique antérieure de très loin aux Gaulois.
L’essor de la préhistoire française devait connaître par la suite une extraordinaire expansion, grâce au travail de Gabriel de Mortillet, inventeur de la chronologie préhistorique actuelle, qui fit entrer de très nombreuses séries archéologiques de référence au Musée. On doit également à Edouard Piette la plupart des pièces d’art paléolithique conservées au Musée, dans la disposition qui a été voulue au début du XXe siècle.
L’archéologie gauloise est littéralement née avec les recherches de Félix de Saulcy, Alexandre Bertrand et Jacques-Gabriel Bulliot sur les lieux de la Guerre des Gaules, en particulier à Alésia et à Bibracte. Dans l’entre deux guerres, c’est Henri Hubert qui devait concevoir une refonte complète des collections du musée, en leur adjoignant une section complète d’archéologie comparée, faisant notamment appel aux découvertes de l’Extrême Orient.
Les grands archéologues du XXe siècle ont contribué à l’enrichissement et à l’étude des collections, comme en particulier l’Abbé Breuil, Louis Capitan, Henri et Jacques de Morgan, l’Abbé Cochet, Joseph Déchelette, et bien d’autres encore.

Des collections nouvelles continuent d’entrer à Saint-Germain. Elles proviennent des recherches actuelles menées en France ou à l’étranger (comme l’extraordinaire série d’objets de Nouvelle-Guinée, collectée parPierre Pétrequin) ou encore d’importantes fouilles de sauvetage, comme l’exceptionnel mobilier des tombes à char gauloises de l’aéroport de Roissy découvert en 1995.